大家好，今天跟大家分享一篇题为 Protosa ppanin A Protects DOX-Induced Myocar dialInjury and Cardiac Dysfunction by Targeting ACSL4/FTH1 Axis-Depen dent Ferro ptosis （原苏木素A通过靶向ACSL4/FTH1轴依赖性铁下垂保护DOX诱导的心肌损伤和心脏功能障碍）这篇文章结合细胞实验、动物实验、RNA测序、蛋白质组微阵列、分子对接和动态模拟等揭示了原苏木素A通过靶向ACSL4/FTH1轴依赖的铁死亡来减轻DOX诱导的心肌损伤和心脏功能障碍的新机制。具体的设计思路跟大麦一起看看吧~
01
研究背景
阿霉素 （DOX） 是一种有效的抗癌剂，但其临床效用受到剂量依赖性心脏毒性的限制，部分原因是心肌细胞铁死亡。然而，开发用于对抗铁死亡的心脏保护药物的进展遇到了障碍。原水蛋白 A （PrA） 是一种源自苏木精的抗炎化合物，显示出对抗 DOX 诱导的心肌病 （DIC） 的潜力。
在这里，据报道 PrA 通过减少 DOX 诱导的铁死亡和维持线粒体稳态来减轻心肌损伤和功能障碍。随后，通过蛋白质组微阵列、分子对接和动力学模拟确定 PrA 的分子靶点。从机制上讲，PrA 与铁死亡相关蛋白酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4 （ACSL4） 和铁蛋白重链 1 （FTH1） 物理结合，最终抑制 ACSL4 磷酸化和随后的磷脂过氧化，同时还阻止 FTH1 自噬降解和随后的亚铁离子释放 （Fe2+） 版本。
鉴于铁死亡在缺血再灌注 （IR） 损伤的发病机制中的关键作用，这项进一步的研究假设 PrA 可以通过抑制铁死亡来赋予对 IR 诱导的心脏损伤的保护作用。总体而言，一种靶向铁死亡的新型药物抑制剂被揭开，并揭示了 DIC 中心肌细胞铁死亡的双重调节机制，突出了化疗药物诱导的心脏毒性和铁死亡触发的疾病的其他治疗选择。
见图一
PrA 减轻 DOX 诱导的心脏损伤。
图一
A） 动物实验过程示意图。简而言之，小鼠用 PrA（5 或 20 mg kg−1，即）、DXZ（铁螯合剂，25 mg kg−1， i.p.）或在第 0 天、第 2 天和第 4 天用 PBS 进行 DMSO，然后进行 DOX（20 毫克千克−1， i.p.）第 2 天，而小鼠仅注射生理盐水作为第 2 天的对照治疗。
B） PrA 的化学结构。
C） 每组小鼠的 Kaplan-Meier 生存曲线 （每组 n = 20）。
D） 显示每组小鼠心脏功能的代表性超声心动图图像。
E-H） LVEF、FS、LVIDd 和 LVID 的定量分析（每组 n = 6）。
I，J） 测量每组血清 CK-MB （五倍稀释） 和 LDH 水平 （每组 n = 6）。K） H&E 染色的代表性图像（每组 n = 6，比例尺 = 100 μm）。
L，M） 天狼星红染色的代表性图像和定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 100 μm）。
N，O） Masson 三色染色的代表性图像和定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 100 μm）。P） 代表性图像和 Q） WGA 染色的定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 20 μm）。R） 代表性图像和 S） TUNEL 染色的定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 20 μm）。图 J 中显示的数据已归一化。汇总数据表示为均值± SEM。使用 C） 对数秩 （Mantel-Cox） 检验和 E-J，K，M，O，Q，S） 单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验计算统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：CK-MB，肌酸激酶-MB;DMSO，二甲基亚砜;DOX，阿霉素;DXZ，右丙亚胺;FS，左心室分数缩短;即胃内;i.p.，腹膜内;LDH，乳酸脱氢酶;LVEF，左心室射血分数;LVIDd，舒张期左心室内部尺寸;LVIDs，收缩期左心室内部尺寸;PBS，磷酸盐缓冲盐水;PrA，原 sappanin A。
见图二
PrA 改善 DOX 诱导的心脏组织中铁死亡。
图二
A-D） RNA-seq 分析揭示了三组小鼠心脏中的 DEGs：对照组（每组 n = 4）、DOX（15 mg kg−1，腹腔内;n = 每组 5）和 DOX + PrA（20 毫克公斤−1，即;n = 4 每组），如图 1A 中所述。A） 代表小鼠心脏组织的 RNA-seq 分析中检测到的显著调控基因的热图。基因表达用行 Z 分数归一化。B） 与对照鼠心脏相比，DOX 处理的小鼠心脏中的 KEGG 通路富集分析。C） 代表小鼠心脏组织 RNA-seq 分析中检测到的铁死亡相关基因的热图。基因表达用行 Z 分数归一化。D） 与 DOX 处理的小鼠心脏相比，PrA 处理的小鼠心脏的 DOX 中调节基因的 GSEA。
E-N） 将小鼠随机分为四组（每组 n = 6）：对照组、DOX、DOX+PrA （5 mg kg−1）和 DOX+PrA（20 毫克公斤−1).E） 小鼠心脏中 Ptgs2 的相对 mRNA 水平。F） 通过免疫印迹法测量 GPX4 、 ACSL4 和 FTH1 的心脏蛋白表达。G） 小鼠中 GPX4 （绿色）、ACSL4 （绿色） 和 FTH1 （绿色） 对 cTnT 进行共荧光免疫组织化学染色的代表性图像;白色箭头表示正区域。测量心脏 MDA、I） 血清 MDA 和 J） 心脏 GSH 水平。K） 代表性图像和 L） DAB 增强的普鲁士蓝染色的 % 面积（比例尺：100 μm）。
M，N） DHE 的代表性图像和定量荧光免疫组织化学染色（比例尺：20 μm）。E，J，L，N） 一些数据被标准化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验计算统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DOX，多柔比星;i.p.，腹膜内;即胃内;PrA，原 sappanin A。
见图三
PrA 保护 H9c2 细胞免受 DOX 触发的铁积累、ROS 产生、脂质过氧化并减轻线粒体功能障碍。
图三
A） 在不同浓度的 DOX 诱导的细胞死亡 24 h 的影响下，通过 CCK8 法检测细胞活力 （每组 n = 6）。
B） 在 DOX 存在下，在对照条件下，PrA 处理对培养的 H9c2 细胞中 DOX 诱导的细胞死亡的保护作用 （1 × 10−6 m，24 小时）或 PrA （50 × 10−6 m 或 100 × 10−6 m，30 h），通过 CCK8 测定检测细胞活力 （每组 n = 6）。用不同浓度的 PrA 预处理 H9c2 细胞 6 h，然后用 1 × 10 刺激−6 m DOX 24 小时。DMSO 用作载体对照。全细胞用于以下测定。
C） PI 染色的代表性图像和 D） PI 阳性细胞的百分比（黑色和白色：相位收缩;红色：PI 染色，比例尺 = 100 μm，每组 n = 6）。
E） Ptgs2 的相对 mRNA 水平（每组 n = 6）。
F） 通过免疫印迹法测量 GPX4 、 ACSL4 和 FTH1 的蛋白表达 （每组 n = 6）。
G，H） 通过 C11-BODIPY 染色结合流式细胞术捕获脂质 ROS 生成和定量分析 （每组 n = 5）。
I） 代表性的 DCFH-DA 染色图像（绿色，比例尺 = 100 μm）。
J） 细胞质 Fe 的代表性荧光图像2+用 FerroOrange 染色（橙色，比例尺 = 20 μm）。
K） MDA 水平和 L） GSH 水平的定量分析（每组 n = 6）。
M） JC-1 染色评估膜电位，mtSOX Deep Red 染色检测线粒体超氧化物水平（红色，聚集体;绿色，单体刻度;紫色，mtSOX Deep Red;比例尺 = 20 μm）。
N） 在 H9c2 细胞中使用 Mito-FerroGreen （MFG） 的线粒体铁的代表性荧光图像。MitoBright LT Deep Red 可对线粒体进行染色（绿色，MFG;紫色，MitoBright LT Deep Red;比例尺：20 μm）。
O） 在 H9c2 细胞中使用 MitoPeDPP 的线粒体 LP 的代表性荧光图像。MitoBright LT Deep Red 可对线粒体进行染色（绿色，MitoPeDPP;红色，MitoBright LT Deep Red;比例尺 = 20 μm）。P） 小鼠心脏线粒体的电子显微镜检查（比例尺 = 2 μm）。A，B，E，K，L） 一些数据被标准化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用 A） 多个未配对的 2 尾学生 t 检验和 B、D、E、H、K-L） 单向方差分析和 Tukey 多重比较检验确定统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DMSO， 二甲基亚砜;DOX，阿霉素;PrA，原 sappanin A;ROS，活性氧。
见图四
鉴定人蛋白质组微阵列上的 PrA 结合蛋白。
图四
A） PrA 和 Bio-PrA 的化学结构。
B） 使用重组人蛋白制备的微阵列鉴定 PrA 结合蛋白的程序示意图。
C） 蛋白质阵列的代表性图像，显示阳性（红色箭头）和阴性对照（蓝色箭头）点，以及 ACSL4（紫色箭头）和 FTH1（绿色箭头）的点。
D） 与铁死亡相关的 PrA 结合蛋白的 KEGG 通路。
E） 与铁死亡相关的 PrA 结合蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络（圆圈大小代表 Z 分数值，橙色：铁死亡途径，绿色：谷胱甘肽代谢途径，蓝色：过氧化物酶体途径。Z 值定义为靶蛋白与 PrA 的结合亲和力）。
F） Bio-PrA 与蛋白质阵列上 ACSL4 和 FTH1 点结合的放大图像。此时会显示 Z 分数。
G） 单独使用生物素作为对照。将 Bio-PrA 添加到链霉亲和素琼脂糖珠中并孵育。用 Bio-Cel 将 H9c2 细胞制备的裂解物加入链霉亲和素-琼脂糖珠中，并收集洗脱液用于 Western Blot 分析。总裂解物用作起始量对照。
H） 分子对接执行 PrA 与 ACSL4 或 FTH1 之间的结合姿势细节。该图显示，PrA 与 ACSL4 Gly-443、Ala-444、Tyr-466 形成π-π 共轭键，并与 ACSL4 Pro-445、Val-488、Ile-567 形成 π-烷基键，而 PrA 与 FTH1 Arg-23 形成π-烷基键，与 FTH1 Asn-22、Gln-84 形成常规氢键。
I） Protosappanin A 与 ACSL4（上图）和 FTH1（下图）结合所涉及的关键残基的每残基能量贡献的直方图。
J） PrA 和 ACSL4 或 FTH1 之间的细胞热转移测定。用 pcDNA3.1-3×Flag-h-ACSL4 （P445A， I567A） -3×Flag-zsgreen-puro 或 pcDNA3.1-3×Flag-h-FTH1/FTH1 （R23A， Q84A）-3×Flag-zsgreen-puro 质粒转染 HEK-293 细胞。使用 GraphPad Prism 9.0 拟合曲线 （每组 n = 3）。缩写：PrA， protosappanin A.
见图五
PrA 阻断心肌细胞中 DOX 诱导的 ACSL4 激活，并减少 ROS 产生和脂质过氧化。
图五
A） 对照小鼠和 DOX 处理 （20 mg kg） 的心脏中 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 的蛋白质印迹分析−1， i.p.）有或没有 PrA 的小鼠（5 或 20 mg kg−1，即）。
B，C） H9c2 细胞暴露于 1 × 10−6 m DOX 的 DOX 进行不同的持续时间。提取总蛋白并测量 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 水平 （每组 n = 6）。
D，E） 用不同浓度的 PrA 预处理 H9c2 细胞 6 h，然后用 1 × 10 刺激−6 m DOX 24 小时，或 H9c2 细胞用 1 × 10 攻击−6 m DOX 24 小时，然后用 100 × 10 处理−6 m PrA 6 小时。DMSO 用作载体对照。全细胞裂解物用于后续实验 （每组 n = 6）。
D） Western blot 用于测定 ACSL4 和 ACSL4 Thr 328 磷酸化水平。
E） ELISA 定量细胞上清液 AA 水平。用抗 ACSL4 的 siRNA 和阴性对照 siRNA （作为对照组） 转染 F-H） H9c2 细胞。
F） Western blot 检测敲低效率。定量显示在右侧（每组 n = 6）。G） 敲低 ACSL4 后 Ptgs2 的相对 mRNA 水平（每组 n = 6）。
H） 敲低 ACSL4 后 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 的蛋白质印迹分析。I-Q） H9c2 细胞用编码 ACSL4 或空载体（阴性对照，NC）的 cDNA 质粒转染。
I） Western blot 用于测定 ACSL4 表达。定量显示在右侧（每组 n = 6）。J） ACSL4 过表达对 DOX 诱导 Ptgs2 水平的影响 （每组 n = 6）。
K） ACSL4 过表达后 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 的蛋白质印迹分析（每组 n = 6）。
L，M） 通过 C11-BODIPY 染色结合流式细胞术对 ACSL4 过表达的 H9c2 细胞进行脂质 ROS 生成和定量分析 （每组 n = 5）。
N，O） 代表性的 DCFH-DA 染色图像和对 ACSL4 过表达 H9c2 细胞的荧光强度的定量分析（绿色，比例尺：100 μm，每组 n = 6）。
P，Q） 流式细胞术和膜联蛋白 V-APC 和 PI 在 ACSL4 过表达 H9c2 细胞中 （每组 n = 6）。C，F，G，I，J，O） 一些数据被标准化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用单因素方差分析确定统计显着性，其中 D、F、I、L、N、P） Tukey 的多重比较检验和 E，H） 多个未配对的 2 尾学生 t 检验。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DOX，多柔比星;i.p.，腹膜内;即胃内;PrA，原 sappanin A。
见图六
PrA 抑制 FTH1 在溶酶体中的自噬降解。
图六
A-D） 对照小鼠和用 DOX 处理的小鼠（含或不含 PrA）的心脏 NCOA4、LC3 II/I 和 FTH1 蛋白水平的蛋白质印迹和定量分析（每组 n = 6）。
E） 通过免疫共沉淀分析对照小鼠和用 DOX 处理的小鼠（有或没有 PrA）的 NCOA4-FTH1 相互作用 （每组 n = 3）。
F） 在对照 H9c2 细胞和用不同浓度的 PrA 处理 6 小时的细胞中测量 FTH1 的相对 mRNA 水平，然后用 1 × 10 刺激−6 m DOX 24 小时（每组 n = 6）。
G） 对照 H9c2 细胞和用不同浓度的 PrA 预处理 6 小时，然后用 1 × 10 刺激的细胞中 NCOA4、LC3 II/I 和 FTH1 的蛋白质印迹分析−6 m DOX 或 24 小时或 H9c2 细胞用 1 × 10 攻击−6 m DOX 24 小时，然后用 100 × 10 处理−6 m PrA 持续 6 小时。H-J） 定量分析图 G 中 H） NCOA4、
I） LC3 II/I 和 J） FTH1 的蛋白质水平（每组 n = 6）。
K） 通过免疫共沉淀分析对照 H9c2 细胞和用 DOX 处理的细胞（含或不含 PrA）中的 NCOA4-FTH1 相互作用 （每组 n = 3）。
L，M） FerroOrange 与 LysoTracker Green 在 H9c2 细胞中共定位的代表性共聚焦图像和定量分析（橙色：FerroOrange，绿色：LysoTracker Green，蓝色：DAPI，比例尺：20 μm，每组 n = 6）。
N） H9c2 细胞中 FTH1 的代表性免疫荧光成像。（绿色：FTH1，红色：LAMP，蓝色：DAPI，比例尺：20 μm）。B-D，F，H-J，M） 一些数据被归一化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验确定统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DOX，多柔比星;PrA，原 sappanin A;SEM，均值的标准误差。
02
研究结论
我们的研究首次揭示了 PrA 通过抑制 ACSL4/FTH1 依赖性铁死亡途径减轻 DOX 诱导的心肌损伤。此外，在心肌 I/R 小鼠模型中阐明了 PrA 的心脏保护和抗铁死亡作用。总的来说，我们的数据表明 PrA 可以作为一种新的双重铁死亡靶向抑制剂，在 DIC 和其他铁死亡介导的疾病中具有可观的进展和转化价值。
好了，今天的文献解读就到这儿来，我们下期再见！如果你正在开展临床研究.需要方案设计.数据管理. 数据分析等支持.也随时可以联系我们。
01
研究背景
阿霉素 （DOX） 是一种有效的抗癌剂，但其临床效用受到剂量依赖性心脏毒性的限制，部分原因是心肌细胞铁死亡。然而，开发用于对抗铁死亡的心脏保护药物的进展遇到了障碍。原水蛋白 A （PrA） 是一种源自苏木精的抗炎化合物，显示出对抗 DOX 诱导的心肌病 （DIC） 的潜力。
在这里，据报道 PrA 通过减少 DOX 诱导的铁死亡和维持线粒体稳态来减轻心肌损伤和功能障碍。随后，通过蛋白质组微阵列、分子对接和动力学模拟确定 PrA 的分子靶点。从机制上讲，PrA 与铁死亡相关蛋白酰基辅酶 A 合成酶长链家族成员 4 （ACSL4） 和铁蛋白重链 1 （FTH1） 物理结合，最终抑制 ACSL4 磷酸化和随后的磷脂过氧化，同时还阻止 FTH1 自噬降解和随后的亚铁离子释放 （Fe2+） 版本。
鉴于铁死亡在缺血再灌注 （IR） 损伤的发病机制中的关键作用，这项进一步的研究假设 PrA 可以通过抑制铁死亡来赋予对 IR 诱导的心脏损伤的保护作用。总体而言，一种靶向铁死亡的新型药物抑制剂被揭开，并揭示了 DIC 中心肌细胞铁死亡的双重调节机制，突出了化疗药物诱导的心脏毒性和铁死亡触发的疾病的其他治疗选择。
见图一
PrA 减轻 DOX 诱导的心脏损伤。
图一
A） 动物实验过程示意图。简而言之，小鼠用 PrA（5 或 20 mg kg−1，即）、DXZ（铁螯合剂，25 mg kg−1， i.p.）或在第 0 天、第 2 天和第 4 天用 PBS 进行 DMSO，然后进行 DOX（20 毫克千克−1， i.p.）第 2 天，而小鼠仅注射生理盐水作为第 2 天的对照治疗。
B） PrA 的化学结构。
C） 每组小鼠的 Kaplan-Meier 生存曲线 （每组 n = 20）。
D） 显示每组小鼠心脏功能的代表性超声心动图图像。
E-H） LVEF、FS、LVIDd 和 LVID 的定量分析（每组 n = 6）。
I，J） 测量每组血清 CK-MB （五倍稀释） 和 LDH 水平 （每组 n = 6）。K） H&E 染色的代表性图像（每组 n = 6，比例尺 = 100 μm）。
L，M） 天狼星红染色的代表性图像和定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 100 μm）。
N，O） Masson 三色染色的代表性图像和定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 100 μm）。P） 代表性图像和 Q） WGA 染色的定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 20 μm）。R） 代表性图像和 S） TUNEL 染色的定量分析（每组 n = 6，比例尺 = 20 μm）。图 J 中显示的数据已归一化。汇总数据表示为均值± SEM。使用 C） 对数秩 （Mantel-Cox） 检验和 E-J，K，M，O，Q，S） 单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验计算统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：CK-MB，肌酸激酶-MB;DMSO，二甲基亚砜;DOX，阿霉素;DXZ，右丙亚胺;FS，左心室分数缩短;即胃内;i.p.，腹膜内;LDH，乳酸脱氢酶;LVEF，左心室射血分数;LVIDd，舒张期左心室内部尺寸;LVIDs，收缩期左心室内部尺寸;PBS，磷酸盐缓冲盐水;PrA，原 sappanin A。
见图二
PrA 改善 DOX 诱导的心脏组织中铁死亡。
图二
A-D） RNA-seq 分析揭示了三组小鼠心脏中的 DEGs：对照组（每组 n = 4）、DOX（15 mg kg−1，腹腔内;n = 每组 5）和 DOX + PrA（20 毫克公斤−1，即;n = 4 每组），如图 1A 中所述。A） 代表小鼠心脏组织的 RNA-seq 分析中检测到的显著调控基因的热图。基因表达用行 Z 分数归一化。B） 与对照鼠心脏相比，DOX 处理的小鼠心脏中的 KEGG 通路富集分析。C） 代表小鼠心脏组织 RNA-seq 分析中检测到的铁死亡相关基因的热图。基因表达用行 Z 分数归一化。D） 与 DOX 处理的小鼠心脏相比，PrA 处理的小鼠心脏的 DOX 中调节基因的 GSEA。
E-N） 将小鼠随机分为四组（每组 n = 6）：对照组、DOX、DOX+PrA （5 mg kg−1）和 DOX+PrA（20 毫克公斤−1).E） 小鼠心脏中 Ptgs2 的相对 mRNA 水平。F） 通过免疫印迹法测量 GPX4 、 ACSL4 和 FTH1 的心脏蛋白表达。G） 小鼠中 GPX4 （绿色）、ACSL4 （绿色） 和 FTH1 （绿色） 对 cTnT 进行共荧光免疫组织化学染色的代表性图像;白色箭头表示正区域。测量心脏 MDA、I） 血清 MDA 和 J） 心脏 GSH 水平。K） 代表性图像和 L） DAB 增强的普鲁士蓝染色的 % 面积（比例尺：100 μm）。
M，N） DHE 的代表性图像和定量荧光免疫组织化学染色（比例尺：20 μm）。E，J，L，N） 一些数据被标准化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验计算统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DOX，多柔比星;i.p.，腹膜内;即胃内;PrA，原 sappanin A。
见图三
PrA 保护 H9c2 细胞免受 DOX 触发的铁积累、ROS 产生、脂质过氧化并减轻线粒体功能障碍。
图三
A） 在不同浓度的 DOX 诱导的细胞死亡 24 h 的影响下，通过 CCK8 法检测细胞活力 （每组 n = 6）。
B） 在 DOX 存在下，在对照条件下，PrA 处理对培养的 H9c2 细胞中 DOX 诱导的细胞死亡的保护作用 （1 × 10−6 m，24 小时）或 PrA （50 × 10−6 m 或 100 × 10−6 m，30 h），通过 CCK8 测定检测细胞活力 （每组 n = 6）。用不同浓度的 PrA 预处理 H9c2 细胞 6 h，然后用 1 × 10 刺激−6 m DOX 24 小时。DMSO 用作载体对照。全细胞用于以下测定。
C） PI 染色的代表性图像和 D） PI 阳性细胞的百分比（黑色和白色：相位收缩;红色：PI 染色，比例尺 = 100 μm，每组 n = 6）。
E） Ptgs2 的相对 mRNA 水平（每组 n = 6）。
F） 通过免疫印迹法测量 GPX4 、 ACSL4 和 FTH1 的蛋白表达 （每组 n = 6）。
G，H） 通过 C11-BODIPY 染色结合流式细胞术捕获脂质 ROS 生成和定量分析 （每组 n = 5）。
I） 代表性的 DCFH-DA 染色图像（绿色，比例尺 = 100 μm）。
J） 细胞质 Fe 的代表性荧光图像2+用 FerroOrange 染色（橙色，比例尺 = 20 μm）。
K） MDA 水平和 L） GSH 水平的定量分析（每组 n = 6）。
M） JC-1 染色评估膜电位，mtSOX Deep Red 染色检测线粒体超氧化物水平（红色，聚集体;绿色，单体刻度;紫色，mtSOX Deep Red;比例尺 = 20 μm）。
N） 在 H9c2 细胞中使用 Mito-FerroGreen （MFG） 的线粒体铁的代表性荧光图像。MitoBright LT Deep Red 可对线粒体进行染色（绿色，MFG;紫色，MitoBright LT Deep Red;比例尺：20 μm）。
O） 在 H9c2 细胞中使用 MitoPeDPP 的线粒体 LP 的代表性荧光图像。MitoBright LT Deep Red 可对线粒体进行染色（绿色，MitoPeDPP;红色，MitoBright LT Deep Red;比例尺 = 20 μm）。P） 小鼠心脏线粒体的电子显微镜检查（比例尺 = 2 μm）。A，B，E，K，L） 一些数据被标准化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用 A） 多个未配对的 2 尾学生 t 检验和 B、D、E、H、K-L） 单向方差分析和 Tukey 多重比较检验确定统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DMSO， 二甲基亚砜;DOX，阿霉素;PrA，原 sappanin A;ROS，活性氧。
见图四
鉴定人蛋白质组微阵列上的 PrA 结合蛋白。
图四
A） PrA 和 Bio-PrA 的化学结构。
B） 使用重组人蛋白制备的微阵列鉴定 PrA 结合蛋白的程序示意图。
C） 蛋白质阵列的代表性图像，显示阳性（红色箭头）和阴性对照（蓝色箭头）点，以及 ACSL4（紫色箭头）和 FTH1（绿色箭头）的点。
D） 与铁死亡相关的 PrA 结合蛋白的 KEGG 通路。
E） 与铁死亡相关的 PrA 结合蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 网络（圆圈大小代表 Z 分数值，橙色：铁死亡途径，绿色：谷胱甘肽代谢途径，蓝色：过氧化物酶体途径。Z 值定义为靶蛋白与 PrA 的结合亲和力）。
F） Bio-PrA 与蛋白质阵列上 ACSL4 和 FTH1 点结合的放大图像。此时会显示 Z 分数。
G） 单独使用生物素作为对照。将 Bio-PrA 添加到链霉亲和素琼脂糖珠中并孵育。用 Bio-Cel 将 H9c2 细胞制备的裂解物加入链霉亲和素-琼脂糖珠中，并收集洗脱液用于 Western Blot 分析。总裂解物用作起始量对照。
H） 分子对接执行 PrA 与 ACSL4 或 FTH1 之间的结合姿势细节。该图显示，PrA 与 ACSL4 Gly-443、Ala-444、Tyr-466 形成π-π 共轭键，并与 ACSL4 Pro-445、Val-488、Ile-567 形成 π-烷基键，而 PrA 与 FTH1 Arg-23 形成π-烷基键，与 FTH1 Asn-22、Gln-84 形成常规氢键。
I） Protosappanin A 与 ACSL4（上图）和 FTH1（下图）结合所涉及的关键残基的每残基能量贡献的直方图。
J） PrA 和 ACSL4 或 FTH1 之间的细胞热转移测定。用 pcDNA3.1-3×Flag-h-ACSL4 （P445A， I567A） -3×Flag-zsgreen-puro 或 pcDNA3.1-3×Flag-h-FTH1/FTH1 （R23A， Q84A）-3×Flag-zsgreen-puro 质粒转染 HEK-293 细胞。使用 GraphPad Prism 9.0 拟合曲线 （每组 n = 3）。缩写：PrA， protosappanin A.
见图五
PrA 阻断心肌细胞中 DOX 诱导的 ACSL4 激活，并减少 ROS 产生和脂质过氧化。
图五
A） 对照小鼠和 DOX 处理 （20 mg kg） 的心脏中 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 的蛋白质印迹分析−1， i.p.）有或没有 PrA 的小鼠（5 或 20 mg kg−1，即）。
B，C） H9c2 细胞暴露于 1 × 10−6 m DOX 的 DOX 进行不同的持续时间。提取总蛋白并测量 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 水平 （每组 n = 6）。
D，E） 用不同浓度的 PrA 预处理 H9c2 细胞 6 h，然后用 1 × 10 刺激−6 m DOX 24 小时，或 H9c2 细胞用 1 × 10 攻击−6 m DOX 24 小时，然后用 100 × 10 处理−6 m PrA 6 小时。DMSO 用作载体对照。全细胞裂解物用于后续实验 （每组 n = 6）。
D） Western blot 用于测定 ACSL4 和 ACSL4 Thr 328 磷酸化水平。
E） ELISA 定量细胞上清液 AA 水平。用抗 ACSL4 的 siRNA 和阴性对照 siRNA （作为对照组） 转染 F-H） H9c2 细胞。
F） Western blot 检测敲低效率。定量显示在右侧（每组 n = 6）。G） 敲低 ACSL4 后 Ptgs2 的相对 mRNA 水平（每组 n = 6）。
H） 敲低 ACSL4 后 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 的蛋白质印迹分析。I-Q） H9c2 细胞用编码 ACSL4 或空载体（阴性对照，NC）的 cDNA 质粒转染。
I） Western blot 用于测定 ACSL4 表达。定量显示在右侧（每组 n = 6）。J） ACSL4 过表达对 DOX 诱导 Ptgs2 水平的影响 （每组 n = 6）。
K） ACSL4 过表达后 ACSL4 和 p-ACSL4 （Thr 328） 的蛋白质印迹分析（每组 n = 6）。
L，M） 通过 C11-BODIPY 染色结合流式细胞术对 ACSL4 过表达的 H9c2 细胞进行脂质 ROS 生成和定量分析 （每组 n = 5）。
N，O） 代表性的 DCFH-DA 染色图像和对 ACSL4 过表达 H9c2 细胞的荧光强度的定量分析（绿色，比例尺：100 μm，每组 n = 6）。
P，Q） 流式细胞术和膜联蛋白 V-APC 和 PI 在 ACSL4 过表达 H9c2 细胞中 （每组 n = 6）。C，F，G，I，J，O） 一些数据被标准化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用单因素方差分析确定统计显着性，其中 D、F、I、L、N、P） Tukey 的多重比较检验和 E，H） 多个未配对的 2 尾学生 t 检验。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DOX，多柔比星;i.p.，腹膜内;即胃内;PrA，原 sappanin A。
见图六
PrA 抑制 FTH1 在溶酶体中的自噬降解。
图六
A-D） 对照小鼠和用 DOX 处理的小鼠（含或不含 PrA）的心脏 NCOA4、LC3 II/I 和 FTH1 蛋白水平的蛋白质印迹和定量分析（每组 n = 6）。
E） 通过免疫共沉淀分析对照小鼠和用 DOX 处理的小鼠（有或没有 PrA）的 NCOA4-FTH1 相互作用 （每组 n = 3）。
F） 在对照 H9c2 细胞和用不同浓度的 PrA 处理 6 小时的细胞中测量 FTH1 的相对 mRNA 水平，然后用 1 × 10 刺激−6 m DOX 24 小时（每组 n = 6）。
G） 对照 H9c2 细胞和用不同浓度的 PrA 预处理 6 小时，然后用 1 × 10 刺激的细胞中 NCOA4、LC3 II/I 和 FTH1 的蛋白质印迹分析−6 m DOX 或 24 小时或 H9c2 细胞用 1 × 10 攻击−6 m DOX 24 小时，然后用 100 × 10 处理−6 m PrA 持续 6 小时。H-J） 定量分析图 G 中 H） NCOA4、
I） LC3 II/I 和 J） FTH1 的蛋白质水平（每组 n = 6）。
K） 通过免疫共沉淀分析对照 H9c2 细胞和用 DOX 处理的细胞（含或不含 PrA）中的 NCOA4-FTH1 相互作用 （每组 n = 3）。
L，M） FerroOrange 与 LysoTracker Green 在 H9c2 细胞中共定位的代表性共聚焦图像和定量分析（橙色：FerroOrange，绿色：LysoTracker Green，蓝色：DAPI，比例尺：20 μm，每组 n = 6）。
N） H9c2 细胞中 FTH1 的代表性免疫荧光成像。（绿色：FTH1，红色：LAMP，蓝色：DAPI，比例尺：20 μm）。B-D，F，H-J，M） 一些数据被归一化。汇总数据表示为 SEM ±平均值。使用单因素方差分析和 Tukey 多重比较检验确定统计显着性。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001， ****p < 0.0001。缩写：DOX，多柔比星;PrA，原 sappanin A;SEM，均值的标准误差。
02
研究结论
我们的研究首次揭示了 PrA 通过抑制 ACSL4/FTH1 依赖性铁死亡途径减轻 DOX 诱导的心肌损伤。此外，在心肌 I/R 小鼠模型中阐明了 PrA 的心脏保护和抗铁死亡作用。总的来说，我们的数据表明 PrA 可以作为一种新的双重铁死亡靶向抑制剂，在 DIC 和其他铁死亡介导的疾病中具有可观的进展和转化价值。
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