一、内参是什么？为什么它如此重要？ 在Western Blot（WB）实验中，内参（Internal Control）就像一把“标尺”，用于校正实验误差，确保目标蛋白的表达差异真实可靠。无论是上样量的波动、转膜效率的不均，还是抗体反应的偏差，内参都能帮助排除干扰，让实验结果更具说服力。 内参的核心作用： 1.校正上样量：通过内参的均一性，验证各组样本是否等量上样。 2.监控实验流程：如电泳分离、转膜效率是否正常。 3.提高数据可信度：期刊通常要求提供内参数据，确保目标蛋白变化的真实性。 常见误区：许多新手默认使用GAPDH或β-actin，却忽略样本类型或实验条件的影响，导致结果偏差。例如，在缺氧或糖尿病模型中，GAPDH的表达可能异常升高，失去参考价值。 二、选择内参的七大原则 1. 样本种属与组织类型 •哺乳动物样本：常用β-actin、GAPDH、β-tubulin，但需注意组织特异性。例如： •心肌或骨骼肌：β-actin表达较低，应改用α-actin。 •脂肪组织：β-actin表达极低，推荐GAPDH或线粒体内参。 •植物样本：选择Plant actin或Rubisco 。 •跨物种实验：优先选择保守蛋白（如GAPDH抗体可能覆盖非洲蟾蜍、小鼠、人等）。 2. 分子量差异 内参与目标蛋白的分子量需相差至少5 kDa，避免条带重叠。例如： •目标蛋白45 kDa时，避免选42 kDa的β-actin，改用36 kDa的GAPDH。 3. 亚细胞定位匹配 根据目标蛋白的分布选择对应内参： •细胞总蛋白：β-actin、GAPDH、β-tubulin。 •核蛋白：Lamin B、Histone H3、PCNA（注意PCNA仅适用于增殖细胞）。 •膜蛋白：ATP1A1（Na+/K+-ATP酶）。 •线粒体蛋白：VDAC1、COX IV。 4. 实验条件的影响 某些处理会干扰内参稳定性： •缺氧或代谢研究：避免GAPDH（因其参与糖酵解，表达易波动）。 •细胞凋亡或增殖实验：避免c-Jun、Lamin B（自身表达可能变化）。 •药物处理（如抗癌药）：β-tubulin可能被抑制，需换用其他内参。 5. 抗体特异性与灵敏度 •高稀释比抗体：如Proteintech的GAPDH抗体 稀释比可达1:500,000，节省成本。 •避免交叉反应：确保内参与目标蛋白的抗体无交叉，必要时分两次显色或剪膜检测。 6. 文献支持与验证 •优先选择高引用抗体：例如GAPDH抗体（被引用超8000次）。 •多内参验证：在关键实验中，同时使用两种内参（如β-actin+GAPDH）提升可信度。 7. 特殊样本的处理 •血浆/血清：选用Transferrin（转铁蛋白）。 •外泌体或分泌蛋白：需结合样本特性选择特异性标志物。 三、常用内参推荐表 蛋白类型 推荐内参 分子量（kDa） 适用场景 细胞总蛋白 GAPDH 36 大多数组织，代谢稳定条件 细胞总蛋白 β-actin 42 非肌肉组织，结构稳定条件 核蛋白 Lamin B1 66-72 核膜完整性验证 膜蛋白 ATP1A1 97-110 细胞膜相关研究 线粒体蛋白 COX IV 17-20 能量代谢或线粒体功能实验 血浆/血清 Transferrin 77 体液样本标准化 四、常见问题与解决方案 Q1：内参条带不齐或无信号？ •可能原因：抗体失效、上样量不足、转膜失败。 •解决方案：更换新鲜抗体、增加上样量、预染Marker验证转膜效率。 Q2：内参表达量差异大？ •可能原因：实验条件影响（如药物处理）、样本提取不均。 •解决方案：更换稳定内参（如核内参替代胞浆内参）、优化裂解步骤。 Q3：目标蛋白与内参分子量接近？ •解决方案：剪膜分别检测，或使用不同荧光标记的二抗。 五、总结 选择合适的内参是WB实验成功的“隐形基石”。新手需牢记：没有万能的内参，只有最适合的实验设计。从样本特性、分子量匹配到抗体验证，每一步都需细致考量。遇到问题时，不妨回归文献，借鉴前人经验，或通过多内参验证排除干扰。 记住：内参选对了，你的WB结果就赢在了起跑线上！