细胞免疫荧光技术是一种基于抗体与标记物相互作用的技术。它通过特异性的抗体与细胞表面或细胞内分子结合，再通过标记物在荧光显微镜下进行观察。实验流程通常包括样品制备、固定、通透、封闭、抗体孵育、复染、封片和观察 8 个部分。
目的 根据实验设计，准备状态良好的细胞样品。细胞培养是实验的基础，细胞状态直接影响实验结果。 ▐ 步骤 1. 准备盖玻片或共聚焦小皿。盖玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，盖玻片完全干燥后移至细胞培养板 中，整个过程注意无菌操作。
2. 铺细胞。在包被的盖玻片或板上铺适当的细胞，使后续固定细胞时，融汇度达到 50-60%。如果细胞过密或过稀，正常细胞结构可能会受到影响。 3. 收集样品。针对贴壁细胞 ，细胞继续培养 12 h，细胞牢牢贴壁后，收集样品进行后续操作。而对于悬浮细胞，可以通过甩片进行。
Tips:
1. 尽量选用新鲜制备的样本，并确定样品中抗原分子的表达丰度；
2. 后续所有操作，动作要轻柔，避免细胞脱落； 3. 后续所有操作都需避免干片。
02 第二步：固定
目的 使用固定剂（如甲醇、丙酮、多聚甲醛等）处理细胞，使蛋白质变性凝固，从而固定细胞形态和结构。同时，固定剂还能减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保护抗原性。
步骤 1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定细胞 10 ~ 15 min；
2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留的固定液。
Tips:
1. 初次实验，建议从 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂。
2. 较长的孵育时间通常会导致更高的固定程度，直至表位可能过度固定。孵育时间短可能导致表位保存不良和样品固定不足。最佳固定时间需要根据经验确定。
03 第三步：通透
目的 通过去污剂部分溶解细胞膜，形成孔洞，从而使抗体能够到达细胞内表位，与细胞内的抗原结合。（该步骤可选做；通透步骤会破坏细胞膜，细胞膜表面抗原不适合选择通透实验）
步骤 1. 通透：加入 0.1–0.25 % Triton X-100 (PBS 配制)，覆盖细胞，室温下通透5-10 min ；
2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留通透液。
Tips:
通透剂的浓度和孵育时间应针对所用样品进行优化。
04 第四步：封闭
目的 封闭液中的成分能够与细胞表面的非特异性位点结合，从而阻止抗体与这些位点的非特异性结合。
封闭液的选择 可以选择与二抗相同来源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗为山羊抗小鼠，应选择山羊血清作为封闭剂。
步骤 使用 2-10% 的 BSA /山羊血清，室温或 37 ℃ 封闭 1 h。
Tips:
1. 封闭溶液不应含有一抗的宿主动物血清，因为这可能会导致高背景。
2. 注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
05 第五步：抗体孵育
目的 使抗体充分与目的蛋白抗原结合，决定了荧光信号的位置和特异性，进而影响实验结果的准确性和可靠性。
注意：该步骤可选择 (i) 直接检测，一抗直接与荧光基团偶联。(ii) 间接检测，使用合适的荧光标记二抗检测一抗。这两种方法各有优点和缺点，其中，间接检测是最常用的检测方法。
抗体的选择 1. 单染：一抗要选择任一宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。例如，一抗是小鼠来源，二抗要选择抗小鼠的抗体 (如山羊抗小鼠，驴抗小鼠等)。
2. 双染/多染：在进行多个荧光标记实验时，一抗要选择不同宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。同时要注意选择具有高区分度的荧光二抗，避免荧光重叠。例如，在进行三色荧光标记时，一般选用绿色、蓝色和红色这三种荧光基团 ，以确保每个信号都能被清晰地区分出来。
步骤 (以间接检测为例)：
1. 一抗孵育：根据研目标抗原和样品特性选择符合要求的一抗，并按照说明书要求稀释一抗，加入到样品中并在 4 ℃ 条件下孵育过夜 (12 ~ 16 h)。 2. 洗涤：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。 3. 二抗孵育：根据一抗的种类及样品特性 (二抗携带的荧光需要与样品自带荧光不冲突) 选择合适的荧光标记的二抗，在室温下避光孵育 1 h。稀释和使用方法应遵循说明书。 4. 洗涤：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。
Tips:
1. 孵育荧光二抗之后，一定要注意避光保存！
2. 确定合适的二抗工作浓度浓度，避免无信号或背景过高现象的发生； 3. 注意湿盒的保湿效果，避免样品的干燥； 4. 洗涤时转速要温和，防止细胞脱片。
06 第六步：复染
目的 使用染色剂对细胞核进行染色，直观地区分细胞核和其他细胞及抗原结构 的位置，便于观察和解读实验结果。
步骤 在清洗完毕的细胞中滴加 DAPI，室温避光静置约 30 s。
07 第七步：封片
目的 保护已经染色的样本，防止其受到外界环境的损害。同时，封片还有助于保存实验结果，便于后续的分析和比较。
步骤 1. 封片：向载玻片上加入一滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在面靠近载玻片，用吸水纸吸除多余封片剂。
2. 观察：轻轻用指甲油密封盖玻片四周，避免样品在显微镜下移动。指甲油干透后，直接观察或 4 ℃ 下避光保存。
Tips:
1. 避免气泡：在封片过程中，需要避免产生气泡。气泡会干扰显微镜下的观察，影响实验结果的准确性。因此，在滴加封片液时，需要缓慢而均匀地滴加，并用镊子轻轻调整盖玻片的位置，以确保没有气泡产生。
2. 选择合适的封片剂：封片剂的选择也很重要。常用的封片剂包括缓冲甘油、抗荧光淬灭封片液等。在选择封片剂时，需要根据实验的具体需求和标本的特性进行选择。 3. 保持避光和湿度：封片后，需要将标本放置在避光和湿度适宜的环境中保存。这可以有效地防止荧光信号的淬灭和标本的干燥，确保实验结果的稳定性和准确性。 4. 细胞样品在封片剂处理后，理论上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，为了成像清晰和高荧光强度，建议尽快进行成像分析。
08 第八步：观察
成像及分析：在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，并对荧光定位及结果进行实验分析。
目的 根据实验设计，准备状态良好的细胞样品。细胞培养是实验的基础，细胞状态直接影响实验结果。 ▐ 步骤 1. 准备盖玻片或共聚焦小皿。盖玻片需提前浸泡在 70% 乙醇中，盖玻片完全干燥后移至细胞培养板 中，整个过程注意无菌操作。
2. 铺细胞。在包被的盖玻片或板上铺适当的细胞，使后续固定细胞时，融汇度达到 50-60%。如果细胞过密或过稀，正常细胞结构可能会受到影响。 3. 收集样品。针对贴壁细胞 ，细胞继续培养 12 h，细胞牢牢贴壁后，收集样品进行后续操作。而对于悬浮细胞，可以通过甩片进行。
Tips:
1. 尽量选用新鲜制备的样本，并确定样品中抗原分子的表达丰度；
2. 后续所有操作，动作要轻柔，避免细胞脱落； 3. 后续所有操作都需避免干片。
02 第二步：固定
目的 使用固定剂（如甲醇、丙酮、多聚甲醛等）处理细胞，使蛋白质变性凝固，从而固定细胞形态和结构。同时，固定剂还能减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保护抗原性。
步骤 1. 固定：使用 4% 的多聚甲醛固定细胞 10 ~ 15 min；
2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留的固定液。
Tips:
1. 初次实验，建议从 4% 的多聚甲醛,固定 15 min 开始尝试，倘若没有达到预期效果，再调整固定时间或更换另一种固定剂。
2. 较长的孵育时间通常会导致更高的固定程度，直至表位可能过度固定。孵育时间短可能导致表位保存不良和样品固定不足。最佳固定时间需要根据经验确定。
03 第三步：通透
目的 通过去污剂部分溶解细胞膜，形成孔洞，从而使抗体能够到达细胞内表位，与细胞内的抗原结合。（该步骤可选做；通透步骤会破坏细胞膜，细胞膜表面抗原不适合选择通透实验）
步骤 1. 通透：加入 0.1–0.25 % Triton X-100 (PBS 配制)，覆盖细胞，室温下通透5-10 min ；
2. 洗涤：使用 PBS 缓冲液清洗 3 次，以去除残留通透液。
Tips:
通透剂的浓度和孵育时间应针对所用样品进行优化。
04 第四步：封闭
目的 封闭液中的成分能够与细胞表面的非特异性位点结合，从而阻止抗体与这些位点的非特异性结合。
封闭液的选择 可以选择与二抗相同来源的血清或者 BSA 等，例如，若二抗为山羊抗小鼠，应选择山羊血清作为封闭剂。
步骤 使用 2-10% 的 BSA /山羊血清，室温或 37 ℃ 封闭 1 h。
Tips:
1. 封闭溶液不应含有一抗的宿主动物血清，因为这可能会导致高背景。
2. 注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
05 第五步：抗体孵育
目的 使抗体充分与目的蛋白抗原结合，决定了荧光信号的位置和特异性，进而影响实验结果的准确性和可靠性。
注意：该步骤可选择 (i) 直接检测，一抗直接与荧光基团偶联。(ii) 间接检测，使用合适的荧光标记二抗检测一抗。这两种方法各有优点和缺点，其中，间接检测是最常用的检测方法。
抗体的选择 1. 单染：一抗要选择任一宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。例如，一抗是小鼠来源，二抗要选择抗小鼠的抗体 (如山羊抗小鼠，驴抗小鼠等)。
2. 双染/多染：在进行多个荧光标记实验时，一抗要选择不同宿主来源的抗体，二抗选择对应的抗一抗宿主的抗体。同时要注意选择具有高区分度的荧光二抗，避免荧光重叠。例如，在进行三色荧光标记时，一般选用绿色、蓝色和红色这三种荧光基团 ，以确保每个信号都能被清晰地区分出来。
步骤 (以间接检测为例)：
1. 一抗孵育：根据研目标抗原和样品特性选择符合要求的一抗，并按照说明书要求稀释一抗，加入到样品中并在 4 ℃ 条件下孵育过夜 (12 ~ 16 h)。 2. 洗涤：回收一抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5~10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。 3. 二抗孵育：根据一抗的种类及样品特性 (二抗携带的荧光需要与样品自带荧光不冲突) 选择合适的荧光标记的二抗，在室温下避光孵育 1 h。稀释和使用方法应遵循说明书。 4. 洗涤：去除/回收二抗工作液，用 TBST/PBST 摇床缓慢清洗 3 次，每次 5 ~ 10 min，以去除未结合的抗体。洗涤次数和时间可根据实验条件调整。
Tips:
1. 孵育荧光二抗之后，一定要注意避光保存！
2. 确定合适的二抗工作浓度浓度，避免无信号或背景过高现象的发生； 3. 注意湿盒的保湿效果，避免样品的干燥； 4. 洗涤时转速要温和，防止细胞脱片。
06 第六步：复染
目的 使用染色剂对细胞核进行染色，直观地区分细胞核和其他细胞及抗原结构 的位置，便于观察和解读实验结果。
步骤 在清洗完毕的细胞中滴加 DAPI，室温避光静置约 30 s。
07 第七步：封片
目的 保护已经染色的样本，防止其受到外界环境的损害。同时，封片还有助于保存实验结果，便于后续的分析和比较。
步骤 1. 封片：向载玻片上加入一滴封片剂，将盖玻片缓慢扣在载玻片上，细胞所在面靠近载玻片，用吸水纸吸除多余封片剂。
2. 观察：轻轻用指甲油密封盖玻片四周，避免样品在显微镜下移动。指甲油干透后，直接观察或 4 ℃ 下避光保存。
Tips:
1. 避免气泡：在封片过程中，需要避免产生气泡。气泡会干扰显微镜下的观察，影响实验结果的准确性。因此，在滴加封片液时，需要缓慢而均匀地滴加，并用镊子轻轻调整盖玻片的位置，以确保没有气泡产生。
2. 选择合适的封片剂：封片剂的选择也很重要。常用的封片剂包括缓冲甘油、抗荧光淬灭封片液等。在选择封片剂时，需要根据实验的具体需求和标本的特性进行选择。 3. 保持避光和湿度：封片后，需要将标本放置在避光和湿度适宜的环境中保存。这可以有效地防止荧光信号的淬灭和标本的干燥，确保实验结果的稳定性和准确性。 4. 细胞样品在封片剂处理后，理论上可以在 -20℃/4℃ 冰箱保存 1 周。然而，为了成像清晰和高荧光强度，建议尽快进行成像分析。
08 第八步：观察
成像及分析：在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察并采集图像，并对荧光定位及结果进行实验分析。
